研究總結

Lon蛋白酶是屬於AAA+家族的多功能蛋白質，泛存於各物種中，其中人類Lon具有兩同源體(homologue)，一於粒線體(本論文探討對象)，另一則位於過氧化酶體。它是ATP驅動的分子機器，同時具有蛋白酶、chaperone及DNA結合特性。正因為它具有多樣功能，繫於細胞的存亡，我們對Lon的瞭解也模糊於其多種功能之間，例如它的DNA結合能力，究竟是為了引導Lon到DNA所在位置以便其水解與DNA調控相關蛋白，或是Lon實際上直接參與DNA複製轉錄之調控，無法釐清。為確定Lon對DNA結合的特異性，我們在此篇論文詳細分析Lon對不同DNA序列的熱力學驅動力(thermodynamic driving forces)，以及焓、亂度對溫度的依賴性，以探討在生物合理溫度範圍內是由何種參數主導反應發生，以及機制為何。

首先我們以一系列的電泳與圓二色光譜實驗，就競爭量(mass competition)多寡粗略推斷Lon對單股、雙股及四股DNA的結合能量層級有顯著差異，並證實人類Lon蛋白酶對G-quartet四重螺旋DNA有特殊偏好，這項發現看似吸引人卻潛藏著誤估其生理意義的可能性，原因在於Lon是相當龐大的蛋白質，它的單體約100kDa，且傾向六到七個組合為多體，這樣的蛋白質可能碰巧表面有相當面積的正價胺基酸，而得與負價的聚合物(如G-quartet DNA)作用，剖析之間的熱力學得以讓我們瞭解Lon與G-quartet作用是否真具生理意義。

結果顯示，人類Lon對粒線體DNA(mtDNA)上諸多G-quartet序列有著相似的結合強度與自由能變化，與這些序列的結合並伴隨著極微弱或可忽略的比熱變化，惟存在一個例外－那即是座落於mtDNA複製/轉錄主要調控區段的序列，我們稱為LSP(light strand promoter region)。Lon與LSP序列的結合在20℃以上均由焓變化主導，並導致比熱的遽減，其程度約莫相當51個胺基酸殘基參與摺疊反應，表示Lon與LSP的結合造成蛋白質區域性的結構變化(輔以圓二色光譜證實)，比較LSP之G-quartet核心序列與Lon的結合，其反應在生物合理溫度範圍間均為亂度主導，並且無明顯之比熱變化。我們提出一套理論解釋這樣的現象－Lon傾向於結合至mtDNA上的G-quartet形成區域，換句話說這些序列為招募Lon的熱點(hotspot)，然而Lon可以結合這些大部分的序列並很輕易的離開，惟當它找尋到像LSP這般特殊標的，它們的結合造成整體結構變得緊密(依比熱變化程度判斷為熱擾亂度的降低)，這樣具有序列特異性的結合致使結構改變，我們認為跟Lon直接參與mtDNA調控有莫大關係。

本篇論文以發表於去年三月份的核酸研究期刊(Nucleic Acids Research)，但事實上我們的故事還沒完全說完，在這當中發現一些前人未曾指出的有趣現象，像是mtDNA存在G-quartet的生理意義為何?我們只知道mtDNA序列歧異，即一股為guanine-rich，我們稱之為H股，另一為互補的L股，經由G-quartet預測程式分析，H股上佈有約二十個G-quartet高發生區，大部分並座落於結構鬆散的”D-loop”區域，因此就序列組成與微環境許可度來看，mtDNA確實可能發生G-quartet這樣的結構，並且除了本文的Lon蛋白酶外，粒線體存有其他潛在的G-quartet結合蛋白，只是相關文獻的可見度不高，多年來一直被忽略，如拓譜酶I型(粒線體具有同源體)與端粒反轉錄酶(視情況轉移至粒線體)，我們期望在未來能進一步探討這些粒線體G-quartet結合蛋白，以及G-quartet這樣區域性DNA結構功能為何，它們的結合與mtDNA類核的組織或複製轉錄的關聯將是非常值得關注的題目。